海藻糖在凍干保護中的應用分享

1.    引言

慢病毒載體（Lentiviral Vector，LV），基于人類免疫缺陷型病毒（HIV）發展，不僅對分裂細胞，而且對非分裂細胞都具有侵染能力。它能在體內長期穩定地表達基因，因此在腫瘤免疫的過繼性細胞療法中，特別是TCR-T和CAR-T細胞療法中得到了大面積應用。其中，慢病毒載體在CAR-T細胞的生產環節中起到關鍵作用，通過攜帶目的基因的慢病毒載體侵染T細胞。而慢病毒的滴度，直接關系到侵染是否成功，是這一過程中的關鍵因素。

然而，慢病毒載體由蛋白質和核酸組成，這使得其儲存條件面臨與其他生物制品類似的挑戰。例如，它通常無法在常溫或4℃冷藏條件下長時間保存，熱穩定性差，且反復凍融會降低其滴度。目前，尚無理想的慢病毒載體凍存保護液，即使采用-80℃冷凍保存或加入甘油保護劑，也無法有效防止慢病毒載體在儲存過程中滴度降低。此外，慢病毒載體的運輸需要低溫冷鏈，這無疑增加了運輸成本，且無法百分之一百避免運輸帶來的風險。

因此，尋找一種有效的保護劑和儲存方法，以穩定慢病毒載體的滴度并簡化其運輸過程，成為了亟待解決的問題。這其中，海藻糖作為良好的凍干保護劑，憑借其特別的分子結構和理化性質，展現出巨大的應用潛力。

2.    研究分析

華東師范大學沈鴻偉等在慢病毒載體凍干制劑的制備及穩定性研究中發現，海藻糖作為一種良好的凍干保護劑，在制劑制備及穩定性方面發揮了重要作用。這項研究為生物醫藥制劑等相關領域提供了新的思路和方法，進一步推動了海藻糖在慢病毒載體凍干制劑制備中的應用。

海藻糖在凍干保護中的優勢在于其特別的分子結構和理化性質。海藻糖是一種非還原性雙糖，具有較好的熱穩定性、吸濕性和結晶性。在冷凍干燥過程中，海藻糖可以有效地保護生物分子和細胞免受損傷，同時還可以抑制冰晶的形成，減少干燥過程中細胞的破裂。此外，海藻糖還具有良好的化學穩定性和生物相容性，可以與多種藥物和生物分子結合，提高制劑的穩定性和有效性。

在慢病毒載體凍干制劑的制備中，海藻糖可以有效地保護病毒載體免受損傷，提高制劑的病毒滴度和侵染力。同時，海藻糖還可以抑制制劑的聚集和沉淀，提高制劑的均勻性和穩定性。此外，海藻糖還可以通過調節制劑的滲透壓和結晶狀態，控制制劑的復溶時間和質量。

3.    凍干保護劑的選擇

凍干保護劑主要可分為以下幾類:一般為多羥基化合物、糖類、氨基酸、蛋白質、聚合物和無機鹽等化合物。因為凍干保護劑不但要具有保護生物制品活性的效果和結構不發生改變，而且要具有凍干賦形的作用。

糖是一種較的凍干保護劑，本研究中采用的海藻糖屬于二糖，比蔗糖具有更低的吸濕性和更高的玻璃態轉化溫度，其羥基能替代水分子與蛋白質分子表面部分結合，而且海藻糖分子較小，能填充到蛋白質分子的空隙中，有效地限制蛋白質分子內部的結構發生變化，在凍干時可以對慢病毒的蛋白衣殼形成保護，因此凍干制劑保護效果更好。

氨基酸具有酸性羧基和堿性氨基，能夠調節制品溶劑環境的pH值，不同類別的氨基酸具有不同的親水性功能，而親水性強的氨基酸較易與蛋白質產生氫鍵，這對蛋白質在凍干的過程中的穩定性和活性具有重要的保護作用，如組氨酸、丙氨酸等，可以增加慢病毒載體包膜蛋白和組氨酸磷酸鹽緩沖液間的張力，提高慢病毒載體包膜蛋白水化水平。而加入二價陽離子類，如CaCl2和MgSO4這兩種無機鹽，可延遲海藻糖結晶，通過和磷酸根陰離子存在下氫鍵網絡以及分子遷移率的變化抑制結晶。