海藻糖如何冷凍保存人類多能干細胞

之前，我們分享了海藻糖用于人源少突膠質前體細胞（OPC）、脂肪來源干細胞、小鼠睪丸生精細胞等細胞類型冷凍保護的相關研究，發(fā)現向凍存液中添加一定量海藻糖或使用海藻糖+甘油復合型凍存保護劑，可以提升細胞長期凍存后的復蘇活率。

本期，我們分享一篇來自意大利米蘭的研究者們2018年發(fā)表在《Stem Cell Research》上的文獻，看一下海藻糖海藻糖如何冷凍保存人類多能干細胞？

1. 介紹

包括干細胞在內的細胞**產品具有很高的臨床潛力，全球干細胞市場包括上中游的干細胞存儲制備以及下游的臨床應用。根據全球透明市場研究機構（Transparency Market Research）的報告，到2025年底，全球干細胞市場規(guī)模預計達到2705億美元，近8年全球干細胞市場的復合年增長率有望達到13.8%。

為了使細胞**產品成功應用，細胞的長期低溫存儲是必須攻克的技術難點，因為低溫保存是長期保存細胞活力和生化功能的**可用方法。

為了避免細胞內結冰對細胞結構的損害，一些冷凍保護劑已經上市。*常用的細胞冷凍保護劑是二甲基亞砜（DMSO）與胎牛血清或血清替代品聯(lián)合使用。

然而，胎牛血清含有異種動物源蛋白，可能會引起未知病原體的人畜共患**。此外，DMSO具有細胞毒性。據報道，DMSO對組織和細胞的毒性取決于暴露時間、溫度和濃度。毒性程度因細胞類型而異，在未去除DMSO的情況下再次注入解凍細胞的患者中有不良反應的報道。此外，已知DMSO會通過調節(jié)三種DNA甲基轉移酶（Dnmts）的轉錄水平和改變全基因組甲基化譜來影響小鼠胚狀體的表觀基因組，進而導致小鼠干細胞的不受控分化。因此二甲基亞砜+胎牛血清并不適合臨床使用，急需開發(fā)高效無毒的細胞冷凍保護劑。

 海藻糖是一種非還原性雙糖，存在于多種能夠在脫水狀態(tài)下存活的生物中，如細菌、酵母、緩步動物和線蟲。哺乳動物不產生海藻糖，但海藻糖確實是一種有效的冷凍保護劑，可以減少冰晶形成造成的細胞損傷。其保護作用既與滲透效應有關，也與細胞膜磷脂和不穩(wěn)定蛋白的特異性相互作用有關，可防止其因干燥和氧化應激而損傷和變性。

海藻糖不具有細胞毒性，已被有效地用于小鼠精細胞、成人造血干細胞，間質干細胞，脂肪來源干細胞，人類胚胎干細胞（hESCs） 和人類誘導多能干細胞（hiPSCs） 等不同細胞類型的冷凍儲存。此外，海藻糖還用于臍帶血、骨髓、人類移植表肝細胞和人類胰島的冷凍儲存。

阻止海藻糖在細胞保存中廣泛應用的主要障礙是其難以進入細胞內部。以前已經應用了幾種方法，如滲透休克、脂質體遞送、熱穿孔、電穿孔、微量注射和基因工程等方式來幫助海藻糖進入細胞內部。然而，上述方法需要非常繁瑣的操作，費力耗時，且可能導致**的細胞損傷。

該研究探究了在沒有二甲基亞砜及胎牛血清的情況下，使用海藻糖單獨或與乙二醇(乙二醇)或甘油(甘油)聯(lián)合，配制了4種不同的海藻糖復合型冷凍保護劑，低溫保存3種不同類型的多能干細胞系并復蘇，對幾個關鍵參數進行了**研究，包括細胞形態(tài)、解凍后生存能力、多能性標記物表達水平、基因組穩(wěn)定性、內質網(ER)穩(wěn)態(tài)、DNA損傷反應等，以衡量不同海藻糖復合型冷凍保護劑對多能干細胞的低溫保護能力。

海藻糖（供注射用）（無菌）

1、產品名：海藻糖（供注射用）（無菌）

2、中文名稱：D(+)-海藻糖二水合物

3、英文名稱：D（+）-海藻糖二水合物（注射用）

4、化學名稱：α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡糖苷二水合物

5、型號：Hipo-S

6、含量測定：99.3%

7、CAS號：6138-23-4

8、EINECS登錄號：202-739-6

9、備案登記號：F20190000452

10、DMF號：034401

11、質量標準：符合各國藥典標準（Chp，USP，JP，EP）

12、分子式：C12H22O11·2H2O

13、分子量：378.33

14、性狀：白色結晶性粉末

15、比旋度：+198.8°

16、酸度:6.0

17、氯化物:符合規(guī)定

18、硫酸鹽:符合規(guī)定

19、可溶性淀粉:符合規(guī)定

20、熾灼殘渣:0.04%

21、重金屬:符合規(guī)定

22、水分:9.5%

23、有關物質:總雜0.06%，葡萄糖未檢出，麥芽三糖0.06%，**未知單雜未檢出

24、無菌：符合規(guī)定

25、微生物限度：無菌

26、細菌內：<0.1IU/g

27、氮：符合規(guī)定

28、含量測定：99.3%

29、溶解性：易溶于水，溶于熱乙醇，微溶于甲醇，不溶于**、**

30、保存：密封、涼暗干燥處保存，常溫條件下運輸。

31、貨號：008001

32、結構式：